国内精品人妻无码久久久影院蜜桃-国产精品人人妻人人爽-在线视频观看免费视频18-扒开双腿疯狂进出爽爽爽视频-妺妺窝人体色www看美女

2021年10月15日，客服中心反饋某集團(tuán)客戶有藥物篩選的研發(fā)測試需求，通過研究30種中藥提取物對神經(jīng)細(xì)胞TRVP1通道的抑制影響，從而驗(yàn)證植物提取物是否具有止癢、止痛效果。生物實(shí)驗(yàn)室工程師第一時(shí)間與客戶進(jìn)行詳細(xì)溝通，情況如下：

客戶背景

某集團(tuán)公司從一個(gè)資產(chǎn)不足300萬元的生產(chǎn)企業(yè)成長為一個(gè)總資產(chǎn)76.3億多，總銷售收入逾100億元（2010年末），經(jīng)營涉及化學(xué)原料藥、化學(xué)藥制劑、中成藥、中藥材、生物制品、保健食品、化妝品及飲料的研制、生產(chǎn)及銷售；醫(yī)療器械（二類、醫(yī)用敷料類、一次性使用醫(yī)療衛(wèi)生用品），日化用品等領(lǐng)域的云南省實(shí)力最強(qiáng)、品牌最優(yōu)的大型醫(yī)藥企業(yè)集團(tuán)。

樣品名稱

中藥提取物

客戶需求

客戶研究目的是對原料中藥進(jìn)行藥物靶點(diǎn)篩選，通過細(xì)胞毒性測試、膜片鉗、鈣成像等技術(shù)手段，從多種提取物種篩選出能搞有效抑制TRVP1靶點(diǎn)的樣品，進(jìn)行后續(xù)下游的工藝研發(fā)生產(chǎn)。

解決方案

簽訂合同后，生物醫(yī)藥實(shí)驗(yàn)室先進(jìn)行查閱大量文獻(xiàn)，進(jìn)行總體方案設(shè)計(jì)。TRPV1通道蛋白在廣泛表達(dá)于Aδ-纖維及C-型纖維等皮膚感覺神經(jīng)纖維上，激活感覺神經(jīng)元上TRPV1受體，可產(chǎn)生疼痛、灼熱及瘙癢感，并引起P物質(zhì)(Substance P，SP)和降鈣素基因相關(guān)肽(Calcitonin Gene Related Peptide，CGRP)等促炎介質(zhì)的釋放，介導(dǎo)神經(jīng)源性的炎癥，最終導(dǎo)致多種皮膚病和瘙癢癥的發(fā)生。該發(fā)現(xiàn)獲得了 2021年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)獲獎(jiǎng)。本次實(shí)驗(yàn)就針對TRPV1靶點(diǎn)，?進(jìn)行3個(gè)主要藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)，詳情如下。

細(xì)胞毒性測試：

CCK-8試劑在電子載體1-甲氧基 -5-甲基吩嗪 硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被細(xì)胞線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲臜產(chǎn)物（Formazan），生成的甲臜物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。用酶聯(lián)免疫檢測儀在450nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。該方法已被廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞增殖試驗(yàn)、細(xì)胞毒性試驗(yàn)以及藥敏試驗(yàn)等。

測試中，對樣品設(shè)置6-8個(gè)濃度梯度，利用DRG細(xì)胞進(jìn)行30種中藥提取物樣品的細(xì)胞毒性測試， 根據(jù)酶標(biāo)儀原始讀數(shù)計(jì)算樣品特定濃度下的細(xì)胞活力，從而計(jì)算出樣品對細(xì)胞的半致死濃度（CC50），評價(jià)藥物對細(xì)胞的毒性作用。經(jīng)過該項(xiàng)測試，選取細(xì)胞活力為80%的樣品濃度作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的測試最高濃度開展項(xiàng)目實(shí)驗(yàn)。

膜片鉗：

膜片鉗又稱單通道電流記錄技術(shù)，用特制的玻璃微吸管吸附于細(xì)胞表面，可測量單個(gè)離子通道開放產(chǎn)生的pA量級的電流，這種通道開放是一種隨機(jī)過程。通過觀測單個(gè)通道開放和關(guān)閉的電流變化，可直接得到各種離子通道開放的電流幅值分布、開放幾率、開放壽命分布等功能參量，并分析它們與膜電位、離子濃度等之間的關(guān)系，廣泛用于藥物對離子通道受體抑制作用的測試。

測試中，在室溫下用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄相應(yīng)激動(dòng)劑誘發(fā)的通道電流。玻璃微電極由玻璃電極毛胚（BF150-86-10，Sutter）經(jīng)拉制儀（P97，Sutter）拉制而成，灌注電極內(nèi)液后的尖端電阻為2-5 MΩ左右，將玻璃微電極插入放大器探頭即可連接至膜片鉗放大器。鉗制電壓和數(shù)據(jù)記錄由pClamp軟件通過電腦控制和記錄，采樣頻率為10 kHz，濾波頻率為2 kHz。在得到全細(xì)胞記錄后，細(xì)胞鉗制在0 mV，300 ms斜坡電壓從-100 mV至+100 mV，每2 s施加此電壓刺激并給予激動(dòng)劑誘發(fā)通道電流，電流誘發(fā)40 s以上并確定無衰減后開始給藥過程。每個(gè)測試濃度至少給予20 s。數(shù)據(jù)分析處理采用pClamp，GraphPad Prism 5和Excel軟件。不同化合物濃度對TRPV1通道電流（+100 mV時(shí)誘發(fā)的電流幅度）的抑制程度用以下公式計(jì)算：

Inhibition % = [1 –（I / Io）] × 100%

其中，Inhibition % 代表化合物對電流的抑制百分率，I和Io分別表示在加藥后和加藥前電流的幅度，評價(jià)中藥提取物樣品對該通道的抑制作用。

鈣成像：

用熒光探針標(biāo)記樣本中的鈣離子,根據(jù)樣本中的熒光探針特性單色光源發(fā)出單色光,誘發(fā)出熒光。然后根據(jù)傳感器檢測到的熒光特性即可分析樣本中的鈣離子濃度。探針與鈣結(jié)合后不僅產(chǎn)生熒光強(qiáng)度的變化，從而檢測細(xì)胞中鈣離子的濃度變化。

采用高內(nèi)涵蔡司熒光顯微鏡儀器進(jìn)行熒光信號(hào)記錄，20倍的物鏡，曝光100 ms和200 ms各記錄1次加激動(dòng)劑刺激前的，然后開始加入5激動(dòng)劑化合物，測試樣品熒光強(qiáng)度的變化。

客戶反饋

在測試過程中和客戶保持溝通，雖然在細(xì)胞復(fù)蘇、培育階段出了一點(diǎn)問題，但是客戶總體比較滿意。